Carlson-Nilsson, Ulrika
Kartering och nyttjande av genetisk mångfald hos svenska kulturrosor
Inom det SJV/POM-finansierade projektet ”Genetisk variation hos äldre kulturrosor anpassade för svenskt klimat” genomfördes under 2007–2010 ett samarbete mellan POM och forskare vid dåvarande Området för Växtförädling och Bioteknik vid Sveriges Lantbruksuniversitet, Balsgård. I det nu aktuella projektet ”Kartering och nyttjande av genetisk mångfald hos svenska kulturrosor” har detta arbete fortsatt under 2012, då ytterligare 120 okända rosor, som ingår i provodlingen på Fredriksdal, har studerats enligt följande målsättning:
1) att underlätta identifierings- och klassificeringsarbetet av okända kulturrosor i den nationella inventeringen
2) att vinna kunskap om den genetiska variationen mellan de insamlade accessionerna
3) och därmed erhålla ett så bra underlag som möjligt för att utarbeta en strategi inför valet av de rosor som är bevarandevärda och ska ingå i POMs nationella genbank
Ett av POMs mål är att i en nationell genbank bevara största möjliga mångfald av de äldre kulturrosor som finns runt om i Sverige. För att kunna göra detta på ett biologiskt och ekonomiskt tillfredsställande sätt måste variationen i hela eller delar av det inventerade materialet på något sätt uppskattas. Först därefter kan storleken och utformningen av genbanken fastställas.
Vid den slutliga selektionen av rosor för den nationella genbanken kommer resultat från DNA-studierna att vägas samman med resultat från morfologiska studier och kulturhistoriska aspekter. I identifieringsarbetet kommer jämförelser göras med rosor i referenssamlingar, både i Sverige och utomlands. Äldre litteraturuppgifter är andra källor som kommer att få stor betydelse för identifieringen av de funna rosorna.
Vid evalueringen av insamlat material kommer resultaten från DNA-profilerna i många fall ha en avgörande betydelse för arbetet med att selektera rosor för den nationella genbanken. Med DNA-profilerna kan såväl unika rosor som dubblettmaterial identifieras med hög säkerhet.
Under 2012 studerades inom projektet 120 nya accessioner i provodlingen på Fredriksdal. Dessa hör i första hand till Bourbon-Gruppen, Gallica-Gruppen, Spinosissima-Gruppen, Remontant-Gruppen och Rugosa-Gruppen. Även några enstaka accessioner i några särskilt kritiska sortkomplex, som dessutom är svåra att placera i en sortgrupp, ingick. Dessutom upprepades analyser av ett antal okända accessioner från tidigare år som fortfarande inte erhållit resultat för ett eller flera primer-par.
För framställningen av DNA-profilerna användes mikrosatellit-markörer liksom under tidigare projektår. Sex holländska primer-par, speciellt utvecklade för rosor, användes för att genom PCR-teknik amplifiera specifika mikrosatellit-sekvenser (SSR, Simple Sequence Repeats) i DNAt.
Längden på de resulterande mikrosatellit-fragmenten hos respektive accession bestämdes därefter med hjälp av kapillär-elektrofores. Detta arbete utfördes som köpt tjänst av ett laboratorium vid Den Kgl Veterinaer- og Landbohøjskole (KVL), Köpenhamn, till skillnad från tidigare år då det utförts av Labmedicin Skåne (tidigare Swegene), Malmö.
Genom varje accessions specifika uppsättning av fragment av olika längd för respektive primer-par togs därefter en DNA-profil för de olika accessionerna fram med hjälp av dataprogrammet ”Gene marker”. Ett dendrogram (släktträd) skapades sedan med hjälp av metoden UPGMA (Unweighted pair-group method of arithmetic averages) i statistikprogrammet "SPSS".
Redan preliminära resultat från 2007 visade på en genetisk variation mellan de olika arterna och sorterna i referensdatabasen vilket gjorde att unika DNA-profiler kunde tas fram för flertalet av dessa genotyper.
Under 2008 påbörjades arbetet att skapa DNA-profiler för de insamlade okända rosorna från den nationella rosinventeringen. Informationen som framkom resulterade i vissa förändringar i inventeringsstrategin för 2009 års rosinventering. Det visade sig alltså redan tidigt att kunskaperna från projektet har praktisk betydelse för inventeringsarbetet och i framtiden säkert även för etableringen av POM:s genbank för svenska kulturrosor. Redan 2008 gav studierna helt ny kunskap om de äldre kulturrosornas variation och släktskap, vilket på sikt – när hela rosinventeringen slutförts och utvärderats – kan medföra eventuell omskrivning av rosornas släktträd.
Under 2009 analyserades ytterligare 100 okända accessioner. Detta år fokuserades studien på de sortgrupper som tidigare visat den största genetiska och morfologiska variationen, nämligen rosor i Gallica-, Damascena-, Damascena Bifera-, Alba-, Centifolia-, Centifolia Muscosa-, Francofurtana- samt Bourbon-Gruppen. Rosor i dessa sortgrupper hör också till dem som påträffats oftast under rosinventeringen, de allra vanligaste är gallicarosor och damascenarosor. Ett skäl till att välja dem var att vinna kunskaper om den genetiska variationen inom de största sortgrupperna för att med denna information underlätta inventerings- och insamlingsarbetet under det sista inventeringsåret 2010. Ett dendrogram konstruerades där de 100 accessionerna ingick tillsammans med 49 kända sorter från referensdatabasen tillhörande de ovan nämnda åtta grupperna.
Under 2010 valde vi att ytterligare fördjupa oss i de två stora grupperna gallicarosor och damascenarosor genom att analysera 75 okända inventeringsrosor vars morfologi tyder på tillhörighet till någon av dessa grupper.
Sex av de tillgängliga, under 2007–2009 använda, tio primer-paren valdes ut för 2010 års analyser. Enligt information från en av upphovsmännen till de tio primer-paren är till och med tre tillräckligt för att skilja mellan olika accessioner. Minskningen av antalet primer-par gör arbetet mindre tids- och kostnadskrävande. För flertalet rosor innebär förändringen sannolikt ingen kvalitetsförsämring. Flera rosor, som av inventerarna bedömts vara olika sorter när de studerats på fyndplatserna, har dock visat sig ha samma DNA-profil, enligt den detaljnivå som hittills uppnåtts med sex primer-par. Omvänt har det också i många fall visat sig att rosor, som på fyndplatserna bedömts vara identiska, har skilda DNA-profiler. I taxonomiskt särskilt kritiska sortkomplex kan det därför bli nödvändigt att genomföra ytterligare DNA-analyser med fler primer-par än de nu använda sex för att erhålla så säkra resultat som möjligt.
Förutom att 75 nya okända rosor analyserades, genomfördes 2010 även nya analyser av samtliga ej fungerande okända accessioner från 2008 och 2009 med de sex utvalda primer-paren. Av de totalt 395 okända accessionerna återstod efter 2010 års arbete endast 39 som ännu inte hade resultat för ett eller flera primer-par. Mer än hälften av dessa saknade resultat för enbart ett primer-par.
2010 års studier resulterade bl a i ett dendrogram omfattande 293 okända rosor fördelade på 73 genotyper. Det innehöll både de accessioner från 2010 års insamling som hittills gett resultat (73 st) och ett urval från tidigare års studier av rosor tillhörande de åtta ovan nämnda rosgrupperna (220 st). I dendrogrammet ingick även åtta genotyper från referensdatabasen.
Bland resultaten från de genomförda DNA-studierna finns det många exempel på nödvändigheten att kombinera resultat från både morfologiska och genetiska studier för att den slutliga klassificeringen och valet av enskilda sorter för den nationella genbanken ska bli så korrekt som möjligt. Resultaten från DNA-studierna har sedan växtsäsongen 2010 börjat vägas mot de morfologiska studierna i provodlingen på Fredriksdal. Det är dock först när de insamlade rosorna i provodlingen nått en ålder av 3–5 år som fullständiga morfologiska resultat kan erhållas och värdet av att odla de insamlade rosorna under samma klimat- och odlingsförhållanden kan utvärderas.
Under 2010 undersöktes även möjligheterna att ploiditals-bestämma rosor med hjälp av flödescytometri. Vetskapen om ploiditalen för olika i projektet ingående okända accessioner skulle nämligen underlätta tolkningen av dessa rosors svårtydda analysresultat. Undersökningarna gav dock tyvärr inga definitiva svar om de olika undersökta accessionernas ploidital. Det visade sig att DNA-innehållet hos rosor av olika arter varierar mycket även om de har samma ploidital. Troligtvis beror detta på en variation av storleken på kromosomerna mellan olika arter. Detta gör att flödescytometri, som bygger på jämförelser mellan mängden DNA i de okända provernas cellkärnor och cellkärnor från referensrosor med känt ploidital, kanske inte är den bästa metoden för rosor. Bland annat med tanke på att vi under projektåret 2012 beviljades drygt 25 000:- mindre än vi ansökt om ansåg vi att det åtminstone inte under 2012 fanns ekonomiskt utrymme att fortsätta undersöka tillförlitligheten av denna metod för våra ändamål och utröna huruvida det är lönt att analysera ytterligare rosor.
Under 2012 (2011 beviljades inga medel för projektet) studerades ytterligare 120 okända accessioner från försöksfälten på Fredriksdal på samma sätt som under tidigare år. De aktuella accessionerna hörde i första hand till Bourbon-Gruppen, Gallica-Gruppen, Spinosissima-Gruppen, Remontant-Gruppen och Rugosa-Gruppen. Även några enstaka accessioner i några särskilt kritiska sortkomplex, som dessutom är svåra att placera i en sortgrupp, ingick. Dessutom upprepades analyser av ett antal okända accessioner från tidigare år som fortfarande inte erhållit resultat för ett eller flera primer-par.
2012 års arbete resulterade i ett dendrogram baserat på hittills uppnådda resultat från samtliga års DNA-studier. I detta dendrogram ingår 490 okända rosor, fördelade på 175 kloner/genotyper, analyserade med sex primer-par. För detaljerad information se Sakredovisning 2012 samt Bilaga 1, Dendrogram 2012.
De hittills utförda DNA-analyserna har i flertalet fall bekräftat preliminära morfologiska bestämningar. I några fall har DNA-studierna uppdagat en större genetisk variation än väntat. Under den kommande blomningssäsongen 2013 ska resultaten från DNA-studierna noga vägas mot resultaten från fördjupade morfologiska studier.